Zellkultur

Von Experten für Experten

In den Lebenswissenschaften gilt: Zellbiologie ist nicht alles, aber ohne Zellbiologie ist alles nichts. Denn fast jede noch so gute wissenschaftliche Hypothese muss ihre Richtigkeit zunächst in der kleinsten Einheit des Lebens, der Zelle, unter Beweis stellen. Die Zellkultur ist deshalb aus der Grundlagen- und Arzneimittelforschung nicht mehr wegzudenken. Die Aufklärung komplexer Signalwege, Medikamentenentwicklung, Wirksamkeits- und Toxizitätsstudien oder die Reduktion von Tierversuchen im Sinne der 3R-Regeln? Ohne Zellmodelle kaum denkbar. Die Vielfalt verfügbarer Zelllinien und Kultursysteme, die Ihnen zur Verfügung stehen ist mittlerweile riesig. Primäre und sekundäre Zellen bzw. Zelllinien, in Suspension oder adhärent, zwei- oder dreidimensional kultiviert? Die richtige Auswahl ist entscheidend für den Erfolg Ihrer wissenschaftlichen Arbeit. Was gilt es zu beachten?

Für alle diese Fragen haben Sie mit SARSTEDT einen verlässlichen Partner an Ihrer Seite. Gemeinsam mit Ihnen identifizieren unsere erfahrenen Experten Ihre spezifischen Anforderungen und stellen aus unserem umfangreichen Portfolio die optimale Lösung zusammen. Mit unseren hochqualitativen Kulturgefäßen, Bioreaktoren, Lagerungs- & Filtrationssystemen haben wir für alle Aufgaben die passenden Werkzeuge. Entdecken Sie unsere innovativen Lösungen und profitieren Sie von unserer Expertise in der Zellbiologie.

Zellen und Zelllinien: Die Qual der Wahl

Erste und wichtigste Frage ist dabei oftmals: Welche Zelllinie eignet sich zur Beantwortung Ihrer Fragestellung? Dazu kommen primäre Zellen und sekundäre Zelllinien in Frage.

• Primäre Zellen werden direkt aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Körperflüssigkeiten isoliert. Sie liefern aussagekräftigere Ergebnisse als sekundäre Zelllinien, da sie die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Gewebes, aus dem sie entnommen wurden, genau abbilden. Lebensdauer und Proliferation sind allerdings endlich und langsam, die Kultivierung ist oft aufwendiger und komplexer.

• Sekundäre Zelllinien wie HeLa-, HEK-293- oder CHO-Zellen sind dagegen unbegrenzt teilungs- und überlebensfähig (immortalisiert). Sie lassen sich anhand etablierter Protokolle leicht kultivieren, teilen sich schneller und sind relativ günstig kommerziell erhältlich. Allerdings bilden sie die physiologischen Eigenschaften des Ursprungsgewebes deutlich weniger genau ab als primäre Zellen.

Haben Sie die passenden Zellen bzw. Zelllinien für Ihre Forschungsfrage ausgewählt, lohnt es sich, einige Punkte zu überprüfen:

• Authentizität: Liegt tatsächlich die richtige Zelllinie bzw. der richtige Zelltyp vor?

• Kontamination: Ist die Kultur frei von Mykoplasmen, Viren, Hefen oder Kreuzkontaminationen durch andere Zellen?

• Niedrige Passage: Immortalisierte Zelllinien, z. B. Tumorzellen, weisen häufig eine hohe genetische Instabilität auf und können nach häufiger Passagierung entarten – ist die Passagenzahl also niedrig?

Kulturbedingungen: Alles muss stimmen!

Unabhängig davon, ob Sie mit primären Zellen oder sekundären Zelllinien arbeiten, spielen die spezifischen Kulturbedingungen eine entscheidende Rolle. Das beginnt bereits mit der Auswahl des optimalen Kulturgefäßes.

Zellen, die an Oberflächen adhärieren, haben hier andere Bedürfnisse als in Suspension kultivierte Zellen:

• Hydrophile Kulturgefäße bieten adhärenten Zellen ein optimales Kultursubstrat. Sie erleichtern die initiale Adsorption und spätere Adhäsion der Zellen.

• Hydrophile Kulturgefäße mit zusätzlichen polaren Gruppen erleichtern Primärzellen oder sensitiven Zelllinien die Adsorption und Adhäsion zusätzlich.

• Hydrophobe Kulturgefäße vermindern dagegen die Adhäsion von Suspensionszellen und halten sie in Lösung.

Insbesondere bei adhärenten Zellen muss die Oberfläche des Kulturgefäßes absolut gerade sein, damit Ihre Zellen einen gleichmäßigen Zellrasen bilden und sich nicht etwa an den Rändern absetzen.

Je nach Anwendung stehen Ihnen hierzu unterschiedliche Kulturgefäße zur Verfügung:

• Flaschen: Für hohe Zellzahlen, hoher Schutz vor Kontaminationen durch Schraubverschluss

• Schalen: Für mittlere Zellzahlen

• Platten: Für kleine Zellzahlen, etwa bei Parallelversuchen

Neben dem passenden Kulturgefäß spielen Kulturmedien, Umgebungsfaktoren und der Faktor Mensch eine entscheidende Rolle.

Dreidimensionale Zellkultur:

Es geht rund!

Für viele grundsätzliche Forschungsfragen eignen sich klassische zweidimensionale Zellkulturen. Ergebnisse eines einlagigen Zellrasens aus identischen Zellen lassen sich aber nur sehr begrenzt auf Gewebe, geschweige denn ein Organ oder gar einen gesamten Organismus übertragen.

Um dieser Komplexität möglichst nahe zu kommen, spielen Sphäroidkulturen in der Life-Science-Forschung eine immer wichtigere Rolle, denn:

• Sie bilden Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte.

• Sie können sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzen.

• Ihre 3D-Struktur sorgt für Nährstoff-, Sauerstoff- oder Wirkstoffgradienten.

• Sie schließen die Lücke zwischen der in vitro- und in vivo-Situation.

• Sie können dazu beitragen, Tierversuche zu reduzieren.

BIOFLOAT^TM: Schnell und reproduzierbar zur Sphäroidkultur

Idealerweise können schnell und reproduzierbar einheitliche Sphäroide erzeugt werden – auch, wenn es um anspruchsvolle Zelllinien geht. Die passende Zellkulturplatte kann Ihnen die Arbeit erheblich erleichtern und zu messbar besseren Ergebnissen führen.

Durch seine robuste, hochgradig anti-adhäsive Oberfläche sorgt BIOFLOAT^TM dafür, dass adhärente Zellen bevorzugt Zell-Zell-Kontakte ausbilden. Gegenüber anderen anti-adhäsiven Oberflächen bedeutet das für Ihre 3D-Kultur:

• Schnellere Sphäroidbildung bereits nach 2 bis 24 Stunden je nach Zelllinie

• Höhere Reproduzierbarkeit durch sehr gleichmäßige, runde Sphäroide

• Zuverlässige Sphäroidbildung, auch bei anspruchsvollen Zelllinien

Als 96-Well-Zellkulturplatte in ANSI/SLAS-Standardabmessung eignet sich BIOFLOAT^TM mit diesen Eigenschaften für automatisierte Hochdurchsatzverfahren, etwa in der präklinischen Phase der Arzneimittelforschung, bei toxikologischen Studien sowie in der Krebsforschung .

TC-Inserts für komplexe Experimente in Zell- und Gewebekultur

Neben der Sphäroidkultur lassen sich in vivo-Bedingungen auch durch die Verwendung von Zellkulturplatten und entsprechenden TC-Inserts abbilden:

• Das 2-Kompartimenten-System bietet Ihren Zellen eine Umgebung, die der in vivo-Situation ähnelt.

• Die Einsätze sind mit einer ultradünnen, mikroporösen Membran ausgestattet, die eine optimale Zelladhäsion ermöglicht.

Das 2-Kompartiment-System ermöglicht Ihnen die Durchführung komplexer Experimente, z. B. von Transport-, Sekretions- und Diffusionsstudien, Kokultivierungen, 3D-Zellkulturen wie organotypische Hautmodelle und mehr.

Zellen im Fokus: Produkte für die Zellmikroskopie

Ein milchiger Film am Boden des Kulturgefäßes, ein trüber Schimmer im Medium der Suspensionskultur, mehr ist mit dem bloßen Auge nicht zu erkennen. Säugerzellen messen zwischen einem und 30 µm, menschliche Zellen im Durchschnitt etwa 25 µm. Zustand oder Wachstum Ihrer Zellkultur lassen sich so nur lichtmikroskopisch beurteilen. Weitere Details, z. B. bestimmte Organellen, Oberflächenmoleküle oder die Expression bestimmter Genprodukte, enthüllt – nach entsprechender Färbung oder Markierung – z. B. der Griff zum Fluoreszenzmikroskop.

Das Produktionswerk Zelle: miniPERM® Bioreaktor

Biomasse oder Zellprodukte wie Proteine effektiv und in größerer Menge herzustellen, ist in herkömmlichen Kulturflaschen eine Herausforderung. Denn neben jeder Menge Fleißarbeit braucht es dafür auch den notwendigen Platz im Inkubator.

Stattdessen bietet sich die Nutzung eines Bioreaktors an, der Ihre Zellen konstant mit Medium versorgt, Stoffwechselendprodukte abführt und eine möglichst hohe Ausbeute sicherstellt.

Im Labormaßstab wünschen wir uns neben hoher Ausbeute eine einfache Handhabung. Die Produktion im miniPERM® Bioreaktor ist dazu ideal.

• Durchdachtes Design: Das 35 ml große Produktionsmodul ist vom 400 ml Versorgungsmodul durch eine Dialysemembran getrennt und versorgt so effektiv Ihre Zellen. Ihr Produkt (< 12,5 kD) verbleibt im Produktionsmodul.

• Hohe Zelldichte: Bis zu 1x10⁷ Zellen / ml sind möglich, das entspricht etwa 20 großen Kulturflaschen oder drei 1-Liter-Rollerflaschen.

• Optimaler Gasaustausch: Die Außenseite des Produktionsmoduls besteht aus einer O₂- und CO₂-durchlässigen Silikonmembran.

• Vielseitig: Es lassen sich unterschiedlichste Säuger-, Pflanzen- und Insektenzellen kultivieren.

• Platzsparend und einfach: Mittels Universaldrehvorrichtung lassen sich bis zu vier Bioreaktoren platzsparend im Inkubator unterbringen.

Troubleshooting: Diese Stolpersteine können Sie vermeiden

Trotz aller Sorgfalt und Erfahrung steckt der Teufel manchmal im Detail. Hier zeigen wir Ihnen häufige Probleme - und wie Sie diese vermeiden können:

• Pipettieren: Schnelles pipettieren stresst Ihre Zellen, im schlimmsten Fall können Sie durch die Scherkräfte zerstört werden. Beim Mediumwechsel sollte die Pipettenspitze nicht den Boden des Kulturgefäßes berühren, um den Zellrasen nicht zu beschädigen.

• Zentrifugieren: Zentrifugieren Sie Ihre Zellen nur so lange und so schnell wie nötig, um die Zellen nicht unnötig zu stressen.

• Kreisförmiges Zellwachstum: Ursachen dafür können Vibrationen in der Umgebung sein. Steht Ihr Inkubator neben einem alten Kühlschrank? Schlagen die Kolleginnen und Kollegen regelmäßig die Türen zu? Wird im Nachbarlabor gerade renoviert?

• Kein Wachstum in der Mitte des Wells: Ist das Flüssigkeitsvolumen im Well zu gering, kann der Meniskus die Zellen zum Rand des Wells drücken. Sammeln sich Ihre Zellen dort in hoher Dichte, kann es zur Kontakthemmung und vermindertem oder keinem Wachstum mehr kommen. Ausreichende Mengen an Kulturmedium schaffen Abhilfe.

• Mykoplasmen: Die unter dem Lichtmikroskop unsichtbaren Bakterien können Wachstum und Stoffwechsel Ihrer Zellen gravierend beeinträchtigen oder verändern. Durch ihre fehlende Zellwand sind sie gegen viele im Labor genutzten Antibiotika wie Penicillin, Strepta- oder Gentamycin resistent. Auch Sterilfilter bis 0,2 µm Porengröße passieren sie recht problemlos. Regelmäßige Kontrollen, z. B. mit PCR-basierten Tests, schaffen Gewissheit, eine sterile Arbeitsweise reduziert das Risiko.

• Kreuzkontaminationen und Authentizität: Ist Ihre Zelllinie die, für die Sie sie halten? Die Frage ist durchaus berechtigt, denn Kreuzkontaminationen kommen in Laboren, in denen mit unterschiedlichsten Zelllinien gearbeitet wird, durchaus vor. Vor und nach einem Projekt lohnt sich deshalb ein genauer Blick auf die eigene Zellkultur.

Zellmaterialien richtig lagern: Die Kryokonservierung

Woher nehmen Sie gewöhnlich Ihre primären Zellen oder Zelllinien? Vermutlich aus dem Tiefkühlschrank oder – besser noch – einem Stickstofftank. Die Kryokonservierung ist aus der Zellbiologie nicht wegzudenken, denn viele Zelllinien werden projektbezogen und damit nur temporär benötigt.

Eine Dauerkultivierung ist gleich aus mehreren Gründen nicht sinnvoll. Zeit, Material und auch der Platz im Inkubator sind anderswo besser investiert. Zudem steigt mit jeder weiteren Passage das Risiko, dass Ihre Zellen in Seneszenz gehen oder genetische oder morphologische Veränderungen entwickeln. Eine sorgfältig gepflegte und gelagerte Zellbank schützt Sie außerdem vor dem Verlust ganzer Zelllinien bei Kontaminationen, Geräteausfällen oder Handhabungsfehlern.

Zelllagerung: Zu kalt gibt es (fast) nicht

In vielen Laboren werden Zellen zumindest temporär im Ultratiefkühlschrank bei etwa -80 °C gelagert. Scheinbar ziemlich kalt, für die dauerhafte Lagerung Ihrer Zellen aber ungeeignet. Denn intrazelluläre Eisbildung und Rekristallisation können zu einem schnellen Viabilitätsverlust führen.

Mit einer Lagerung bei < -130 °C in der Gasphase Ihres Stickstofftanks sind Sie auf der sicheren Seite, benötigen aber geeignetes Material, was diesen Temperaturen standhält. Denn jenseits der -80 °C stoßen herkömmliche Kunststoffgefäße aus Polypropylen oder Polycarbonat an ihre Grenzen.

Passendes Material bietet das CryoPure Einfriersystem, dessen Röhren, Racks und Boxen speziell auf diese Temperaturen ausgelegt sind.

Kältestabil bis < -196 °C: CryoPure Röhren, Racks und Boxen sind für extrem kalte Temperaturen optimiert

Ergonomisch: Leichtes Öffnen des Schraubverschlusses mit nur einer Umdrehung, einfache Handhabung durch speziellen Standfuß, Farbcodierung durch farbige Kappen und Codierplättchen

Filtration in der Zellkultur: Alles steril?

Autoklav und Sicherheitswerkbank sorgen bei Ihren Zellkulturarbeiten für sterile Materialien und Arbeitsbedingungen. Möglichst steril sollte natürlich auch die Lebensgrundlage Ihrer Zellen sein: das Kulturmedium. Bei hitzelabilen Bestandteilen ist die Sterilisation im Autoklav allerdings nicht möglich. Sterilfiltration gibt Ihnen trotzdem die Option, Pilze, Mykoplasmen und andere Bakterien sicher zu entfernen.

Schwebstoffe und größere Partikel lassen sich meist mit einem 0,45 µm Filter entfernen, für Bakterien oder Pilze sollte aber bereits ein 0,22 µm Filter zum Einsatz kommen. Wer bei Mykoplasmen auf Nummer sicher gehen möchte, greift am besten zu einer Porengröße von nur 0,1 µm. Durch ihre fehlende Zellwand sind die kleinen Plagegeister so formbar, dass sie durchaus einen 0,2 µm Filter passieren können.

Reinheitsgrade in der Zellkultur: Bleiben Sie sauber!

Zeit, Geld, Energie, Herzblut und eine Menge Frustrationstoleranz – wer wissenschaftlich arbeitet, muss meist alles davon mitbringen. Fast jeder Forschende kennt das Gefühl: Schon beim ersten Blick durchs Mikroskop wird klar, da ist etwas schiefgelaufen. Die eigentlich adhärenten Zellen treiben tot durchs Medium oder es wächst etwas, was dort nicht wachsen sollte.

Versuch und Irrtum, Erfolge und Misserfolge gehören zur wissenschaftlichen Arbeit wie die Pipette in der Hand oder das Mikroskop auf dem Tisch. Unnötige Rückschläge lassen sich aber vermeiden, indem Sie für Ihre Zellkulturarbeiten von Anfang an ein Auge auf die Reinheitsgrade Ihrer Materialien werfen.

Dabei spielen verschiedene Faktoren eine Rolle:

• Sterilität: Garantiert, dass keine lebensfähigen Bakterien oder Pilze in Ihre Kultur eingetragen werden.

• Pyrogen- & Endotoxinfreiheit: Proinflammatorische Stoffe können am Material verbleiben, auch wenn keine lebenden Bakterien mehr vorhanden sind.

• Nicht zytotoxisch: Für vitales Zellwachstum dürfen keine zytotoxischen Stoffe in Ihre Kultur gelangen.

• DNA-Freiheit: Bewahrt die Authentizität Ihrer Zelllinie, denn unter bestimmten Bedingungen kann fremde DNA aus dem Medium von den Zellen aufgenommen werden und ins Genom integriert werden.

• TC-Tested: Produkte mit diesem Reinheitsgrad erfüllen nicht nur die o. g. Anforderungen, sondern sind zudem DNase und RNase frei.

Verschaffen Sie sich einen Überblick über unsere Reinheitsgrade und die SARSTEDT QUALITY.